ADN recombinante: definición y proceso

La técnica del ADN recombinante consiste en introducir el gen seleccionado dentro de un vector. Un vector es una pequeña secuencia de ADN que resulta fácil de aislar, como por ejemplo un plásmido (ADN circular y extracromosómico propio de las bacterias y otros organismos procariotas).

El vector portador del gen de interés se introduce en una célula huésped donde será capaz de replicarse de forma independiente al ADN celular.

Para qué sirve el ADN recombinante

Utilizando la maquinaria de la célula anfitriona, el gen introducido mediante el vector se expresará dando lugar a la síntesis de la proteína codificada por dicho gen. Además, cuando la célula portadora se replique, las células resultantes también contendrán dicho gen, creándose así una nueva línea celular modificada genéticamente.

Imagen: Research Gate

Las etapas de la obtención de ADNr son las siguientes:

1- Aislamiento y purificación del gen de interés

En este primer paso, se trata de aislar el gen a recombinar ( por ejemplo el gen de la insulina humana o de un factor de crecimiento, etc.)

• Obtención de ADN celular: Para ello es necesario el ADN liberar el ADN de las células, que deben ser rotas mediante lisis celular. Al romperse las células liberan su material genético (ADN) junto con otras moléculas como proteínas o RNA, por lo que es necesario aislar y purificar el ADN celular.
• Obtención del gen aislado: Una vez parificado y concentrado el ADN celular es necesario, cortar el ADN mediante enzimas de restricción (enzimas muy específicos que capaces de romper la secuencia de ADN en puntos determinados). La acción de enzimas de restricción adecuados liberan el gen que puede ser aislado mediante técnicas de centrifugación o cromatografía.

2- Formación del ADN recombinante

El vector es el material genético que incorporará el gen aislado y lo transportará al interior de la célula huésped.
El vector suele ser un plásmido (ADN circular propio de procariotas), un virus o un cromosoma creado de forma artificial, que debe cumplir las siguientes características:

• Debe ser fácil de aislar y de pequeño tamaño.
• Debe contener secuencias que sean reconocidas por los factores de introducir el gen deseado.
• Tiene que poder introducirse en la célula huésped para replicarse en su interior de forma independiente al ADN celular.
• Debe contener un marcador genético que permita identificarlo y aislarlo con facilidad, como por ejemplo un gen de resistencia a antibióticos.

Las etapas de esta segunda fase del proceso del ADN recombinante son dos:

1. Cortar el vector: Utilizando los mismos enzimas de restricción utilizados para obtener el gen que se quiere insertar, se realiza un corte en el ADN del vector dejando dos extremos del ADN libres.
2. Insertar el gen: Los extremos libres provocados por la acción de los enzimas de restricción son el punto donde se insertará el gen previamente aislado en la primera etapa de aislamiento y purificación del gen. La unión entre el vector y el gen (que una vez introducido en el vector recibe el nombre de inserto), se produce por acción de la enzima ligasa que cataliza la unión covalente entre el vector y el inserto dando lugar a la molécula de ADN recombinante.

3- Introducción del ADNr en la célula anfitriona

Este paso puede realizarse por distintas técnicas como la de alterar por medios físico-químicos la permeabilidad de la membrana de la célula huésped para que permita el paso del ADNr, la microinyección del ADNr mediante una micropipeta, la introducción del ADNr en liposomas capaces de fusionarse con la membrana celular para liberar su contenido en el citoplasma de la célula huésped.

Las células anfitrionas deben ser células que reproduzcan de forma muy rápida, y se utilizan o bien células bacterianas, de levaduras o bien células cancerosas.

4- Cultivo de las células anfitrionas

Una vez introducido el ADNr en las células anfitrionas estas se cultivan induciendo su división para obtener un gran número de células que contengan el ADNr . Las células se cultivan en placas de Petri que permiten aislar colonias que posteriormente se cultivan en medios líquidos obteniendo de esta forma una gran cantidad de clones (células genéticamente idénticas ).

5- Detección y selección de células que contienen el ADN recombinante

En esta última etapa se trata de identificar las células con ADNr. Para la identificación de dichas células se utilizan marcadores que permiten detectar la presencia del ADNr. Estos marcadores genéticos pueden ser diversos, un ejemplo sería el cultivo de las células anfitrionas en presencia de un antibiótico. Cuando ha sido incorporado previamente al ADNr el gen de resistencia al antibiótico presente en el cultivo.

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